В ходе выполнения проекта проводится сравнительная оценка основных популяций миелоидных клеток, дифференцированных из костного мозга мышей с интактной или нарушенной передачей сигнала от TLR4 и TNF/TNFR с привлечением методов цитометрического и транскриптомного анализа, а также многопараметрического анализа цитокинов и хемокинов.
При активации рецепторов врожденного иммунитета макрофаги подвергаются обширной перестройке метаболизма, или метаболическому репрограммированию. При этом изменения в углеводном и энергетическом обмене в клетках приводят к накоплению метаболитов, играющих ключевую роль в иммунорегуляции, вызывающих активацию инфламмасом и продукцию провоспалительных цитокинов. Дисрегуляция продукции цитокинов может приводить к чрезмерной активации воспаления, что в случае его острого проявления может вызывать «цитокиновый шторм» и синдром активации макрофагов, как например, при COVID-19 или при ВИЧ-инфекции, или переходить в хроническую форму и способствовать развитию аутоиммунных и раковых состояний.
Нами будут изучены метаболические особенности макрофагов костного мозга мышей дикого типа и генетически-модифицированных мышей с нарушениями цитокиновых сигнальных каскадов, активированных различными лигандами рецепторов врожденного иммунитета (в том числе, TLR4), которые будут сопоставлены с профилем продукции растворимых медиаторов воспаления с помощью многопараметрического анализа цитокинов и хемокинов.
Кроме того, будет продолжено изучение иммунной системы «голого землекопа» - H. glaber – уникального долгоживущего животного.
Основные исследуемые параметры: экспрессия поверхностных маркеров на миелоидных клетках с применением методов проточной цитометрии, анализ продукции цитокинов и хемокинов при помощи иммуноферментного анализа и многопараметрического иммунологического теста по технологии Luminex xMAP, оценка метаболической активности в первичных культурах миелоидных клетках (измерение гликолиза и дыхания при помощи Seahorse), анализ экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени и транскриптомного анализа, многопараметрическая конфокальная микроскопия.
В последние годы классические представления об онтогенетическом и функциональном разнообразии популяций миелоидных клеток значительно расширились благодаря развитию технологий транскриптомного анализа, в том числе на уровне отдельных клеток, технологий цитометрии, совмещенной с конфокальной микроскопией и возможностью визуализации клеток, многопараметрического анализа растворимых медиаторов иммунитета, анализа клеточного метаболизма в режиме реального времени. Иммунофенотип, а также метаболический и транскриптомный профиль миелоидных клеток существенно изменяются при активации рецепторов врожденного иммунитета, что может быть установлено сравнением миелоидных клеток от мышей дикого типа и от мышей, имеющих генетические нарушения цитокиновых сигнальных каскадов при различных видах активации рецепторов врожденного иммунитета, таких как Толл-подобные рецепторы. Изучение этих сигнальных каскадов может привести к идентификации новых терапевтических мишеней для лечения различных нарушений иммунной системы.
Миелоидные клетки это важнейший компонент врожденной иммунной системы, выполняющий как защитные, так и гомеостатические функции. В ходе настоящего проекта будет проведено иммунофенотипирование и охарактеризованы транскрипционные и метаболические профили миелоидных клеток костного мозга мышей дикого типа и генетически-модифицированных мышей с нарушениями цитокиновых сигнальных каскадов, при активации различными лигандами рецепторов врожденного иммунитета.
Несмотря на годы активных исследований, многие молекулярные детали передачи сигнала в разных типах клеток и его последствий для иммунного ответа остаются неясными. Так, например, генетическая инактивация одного и того же провоспалительного цитокина, интерлейкина-6 (IL-6), в макрофагах и в дендритных клетках способствует разным физиологическим фенотипам. Другой провоспалительный цитокин, TNF, играет важную роль в гомеостазе миелоидных клеток. В недавних исследованиях было показано, что TNF способствует выживанию гематопоэтических стволовых клеток в костном мозге за счет активации классического сигнального пути NFkB, в то же время, способствуя гибели гранулоцитарно-макрофагальных предшественников. Кроме того, TNF необходим для выживания моноцитов in vivo. Так, недавно стало понятным, что один из рецепторов TNF, TNFR2, является новой иммунологической контрольной точкой (immune check point) в регуляции адаптивного иммунного ответа.
Предположительно, эти знания позволят влиять на развитие иммунного ответа, направляя развитие иммунорегуляторных миелоидных клеток. Практическая значимость проекта состоит в возможности идентификации новых терапевтических мишеней.
Определение на основании данных по транскриптомному, протеомному (продукция цитокинов) и метаболическому анализу иммунофенотипа различных популяций миелоидных клеток мыши и голого землекопа, как в гомеостазе, так и в контексте индукции воспаления. Эти знания помогут определить новые иммунорегуляторные механизмы и идентифицировать новые терапевтические мишени.
