Цели проекта:

Создание отечественной платформенной технологии на основе редакторов оснований (ABE и CBE) для коррекции патогенных точечных мутаций в генах, ассоциированных с наследственными заболеваниями.

Задачи проекта:

• создание клеточно- и тканеспецифичных векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) для доставки редакторов оснований в гепатоциты, адипоциты и мышечные клетки;

• конструирование плазмидных векторов, кодирующих системы ABE и CBE, и подбор высокоспецифичных гидовых РНК (gRNA) для генов PAH (фенилкетонурия) и ATP7B (болезнь Вильсона-Коновалова);

• создание с помощью редакторов оснований in vitro моделей заболеваний — клеточных линий человека с патогенными мутациями;

• демонстрация эффективности и специфичности редактирования на клеточных линиях человека с патогенными мутациями;

• проведение доклинических исследований на животных моделях (мышиная модель фенилкетонурии) для оценки терапевтической эффективности и безопасности.

Публикации по тематике проекта: Alexander Egorov и Dmitry Guschin на Google Scholar и ResearchGate

Проект получил государственную поддержку в виде субсидии из бюджета федеральной территории «Сириус» в целях развития научной деятельности в рамках реализации мероприятия 2.1 «Поддержка программ научно-исследовательской деятельности» Научно-технологического университета «Сириус» государственной программы федеральной территории «Сириус» — «Научно-технологическое развитие федеральной территории «Сириус».

Актуальность проекта

Лечение наследственных моногенных заболеваний — это вызов для системы здравоохранения России. В связи с высокой стоимостью терапии в условиях ограниченного бюджета системы здравоохранения такие расходы создают значительную нагрузку на бюджет страны и систему обязательного медицинского страхования. Заболевание фенилкетонурией (ФКУ) и болезнью Вильсона-Коновалова (БВК) представляют собой серьёзную медико-социальную проблему из-за их высокого распространения: 1 на 7000–8000 новорождённых для ФКУ и 1:18000 для БВК в России.

ФКУ — наследственное нарушение метаболизма ароматической аминокислоты фенилаланина, обусловленное недостаточностью фермента фенилаланин-4-гидроксилазы (PAH) или нарушением синтеза кофактора тетрагидробиоптерина (BH4). Распространённость ФКУ имеет широкую географическую и этническую вариабельность: наиболее распространена среди популяций европейского и ближневосточного происхождения. Согласно данным лаборатории генетической эпидемиологии Медико-генетического научного центра им. Н. П. Бочкова встречаемость фенилкетонурии в России выше общемировой на 50% (1:7000 в России, 1:10000 в мире), а в некоторых популяциях Северного Кавказа достигает 1:332. ФКУ вызывается множеством мутаций в гене PAH. Крупное исследование российских пациентов показало, что c.1222C>T (p.Arg408Trp) —наиболее частая мутация (≈50,9% аллелей). Эта же замена лидирует и в европейской популяции (~22,2% аллелей PAH). Среди других распространённых вариантов — c.782G>A (p.Arg261Gln), c.842C>T (p.Pro281Leu), c.781C>T (p.Arg261Ter).

Без своевременной диагностики и адекватного лечения фенилкетонурия приводит к выраженным нейропсихологическим нарушениям вследствие токсического накопления фенилаланина. Современный стандарт терапии включает строгую диету с ограничением содержания фенилаланина, а также фармакологические препараты, такие как сапроптерин и пегвалиаза. Тем не менее даже при тщательном соблюдении диеты контроль уровня фенилаланина зачастую оказывается недостаточным, особенно у пациентов с тяжёлыми мутациями гена PAH, приводящими к резкому снижению или полной утрате активности фермента. В последние годы активно развиваются экспериментальные подходы, включая фермент-заместительную терапию и методы генной терапии. В этой связи всё большее внимание привлекают точечные и потенциально безопасные стратегии — в первую очередь, генетическое редактирование с использованием редакторов оснований (base editors), способных корректировать мутации на уровне ДНК без введения двухцепочечных разрывов, обеспечивая физиологически адекватную экспрессию PAH.

Научная и практическая значимость проекта

Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) — тяжёлое прогрессирующее наследственное аутосомно-рецессивное заболевание, связанное с нарушением экскреции меди из организма. Причиной заболевания являются патогенные мутации в гене транспортёра меди ATP7B, что приводит к избыточному накоплению в паренхиматозных тканях и поражению мозга и печени. На сегодняшний день описано более 300 различных мутаций в гене ATP7B, причём многие пациенты являются двойными гетерозиготами. Наиболее частой является мутация с.3207C>A (p.His1069Gln) — на её долю приходится ~50% патогенных аллелей при БВК в России. Основной проблемой для разработки генозаместительной терапии БВК является размер гена ATP7B — 5.2 kb, что превышает максимальную ёмкость стандартного AAV-вектора. Поэтому актуальной задачей является разработка новых подходов к генной терапии БВК.

Ожидаемые результаты

По итогу реализации проекта:

1. Будет разработана первая в России модульная платформа для редактирования генома на основе адениновых (ABE) и цитозиновых (CBE) редакторов оснований. Платформа позволит в короткое время создавать терапевтические подходы для различных наследственных заболеваний путем замены гидовой РНК, упакованной в липидные наночастицы;

2. Будет создан и охарактеризован набор тканеспецифичных векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV), оптимизированных для эффективной доставки конструктов в клетки-мишени (гепатоциты, адипоциты, мышечные клетки);

3. Будут получены плазмидные векторы, кодирующие системы редакторов оснований (ABE и CBE), подобраны высокоспецифичные гидовые РНК (gRNA) для коррекции конкретных патогенных мутаций в генах PAH (фенилкетонурия) и ATP7B (болезнь Вильсона-Коновалова);

4. Будут созданы in vitro модели заболеваний — клеточные линии человека с патогенными мутациями в генах AIPL1 (врождённый амавроз Лебера типа IV), AhR (пигментный ретинит RP85) и PAM (повышенный риск сахарного диабета 2-го типа);

5. На клеточных линиях человека будет продемонстрирована эффективность и специфичность редактирования целевых мутаций. С помощью методов высокопроизводительного секвенирования (NGS) будет проведена комплексная оценка и минимизация неспецифических эффектов (off-target) редактирования;

6. С применением мышиной модели фенилкетонурии будет показана терапевтическая эффективность разработанной терапии (долговременное снижение уровня фенилаланина в крови);

7. Планируется публикация пяти научных статей в ведущих рецензируемых российских и международных журналах, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus и RSCI. Будут поданы заявки на регистрацию объектов интеллектуальной собственности (патенты) на разработанные генетические конструкции.

Партнеры