Молекулярная биология

1) «Создание моделей наследственных заболеваний сетчатки глаза человека на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)»

За последние несколько лет появилось значительное количество сообщений о получении ИПСК пациентов с различными заболеваниями. Модели на основе ИПСК позволяют изучать фенотипические особенности клеток, их метаболизм, потенциал к дифференцировке, а также оценивать эффективность и применимость генотерапевтических подходов для лечения, например, болезни Паркинсона, спинальной мышечной атрофии, мышечной дистрофии Дюшенна, оптических нейропатий, ретинопатий и многих других заболеваний.  
В ходе таких исследований можно изучать, как ведут себя в культуре сами ИПСК и полученные из них дифференцированные производные, а также использовать полученные клетки как микромодель заболевания для апробации in vitro новых генотерапевтических препаратов, созданных, например, на основе адено-ассоциированных вирусных векторов (AAV).  

В рамках научного проекта предполагается:

• репрограммировать клетки кожи или крови пациентов с заболеваниями сетчатки в ИПСК;
• охарактеризовать полученные ИПСК;
• наработать, охарактеризовать и провести трансдукцию полученных ИПСК с помощью рекомбинантных AAV, несущих терапевтические гены;
• провести дифференцировку полученных ИПСК в целевые дифференцированные клетки, создав модель заболевания;
• охарактеризовать полученные дифференцированные производные;
• оценить дифференцировочный потенциал больных и здоровых клеток;
• проверить жизнеспособность дифференцированных производных клеток пациентов по сравнению с нормальными здоровыми клетками;
• сравнить митохондриальный и свободно-радикальный статус здоровых и больных клеток, оценить клеточное дыхание полученных клеток, а также оценить способность AAV-векторов с терапевтическими генами восстанавливать здоровый фенотип клеток.

Научный руководитель: Гершович Юлия Геннадьевна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник направления «Генная терапия» Научно-технологического университета «Сириус», является автором более более15 научных работ, h-индекс – 8, клеточный биолог, специалист в части изучения и использования стволовых клеток, имеет опыт работы над проектами по тканевой инженерии в Университете Райса, а также биотехнологической компании ООО «Селлтера Фарм» (МБЦ Генериум).

2) «Изучение функциональной активности ко-шаперона AIPL1 при амаврозе Лебера»

Причиной возникновения амавроза Лебера (LCA) являются аутосомные рецессивные мутации в гене AIPL1, кодирующего шаперон фосфодиэстеразы PDE6. Нарушение функций PDE6 приводит к необратимым дегенеративным изменениям в зрительном нерве и слепоте. Некоторые мутации в AIPL1, связанные с LCA, влияют на функциональную активность белка и его способность связываться либо с фарнезилированными, либо с нефарнезилированными белками, в то время как другие мутации не влияют на взаимодействия белков, но приводят к неправильной сборке и нарушению модуляции уровней цГМФ PDE6. 

Задача данного проекта заключается в: (1) создании молекулярной модели взаимодействий AIPL1 с двумя типами белков, нефарнезилированными и фарнезилированными; (2) изучении эффекта патогенных мутаций в AIPL1 на эти взаимодействия; (3) использовании разработанной модели для подтверждения эффективности создаваемого геннотерапевтического препарата для лечения амавроза Лебера; и (4) использовании данной модели в качестве диагностического скрининга для изучения эффекта новых патогенных мутаций в AIPL1 и других белках комплекса фототрансдукции.

В рамках проекта будет проведен анализ субклеточной локализации и белок-белковых взаимодействий AIPL1 дикого типа (WT) в сравнении с вызывающими патологию вариантами AIPL1. 
WT AIPL1 и варианты AIPL1 будут совместно экспрессироваться либо с нефарнезилированными (NUB1, SUGT1, UBD, UBA6 и др.), либо с фарнезилированными (субъединицы PDE6, PDE5a и DNAJA2 и др.) белками.

Субклеточная локализация изучаемых белков будет оценена с помощью иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии. 
Белок-белковые взаимодействия будут подтверждены анализом NanoBRET (Promega), ко-иммунопреципитацией, вестерн-блоттингом, иммунофлуоресцентным анализом и ИФА, измеряющим степень модуляции цикла гидролиза цГМФ. 

Научный руководитель: Минская Екатерина Сергеевна – PhD, ведущий научный сотрудник направления «Генная терапия» Научно-технологического университета «Сириус», является автором более 20 научных работ, h-индекс 7, количество цитирований более 1000, работала в ведущих молекулярно-биологических и биохимических центрах Германии, Великобритании и Португалии по проектам в области создания моделей заболеваний, генетического редактирования, биоинженерии, иммунологии и вирусологии.

3) «Комбинированная иммунотерапия на основе онколитического VSV и CAR-T клеток для повышения эффективности лечения солидных опухолей»

Генетически модифицированные Т-клетки (CAR-T клетки), «вооруженые» против специфических антигенов опухолевых клеток, успешно используются для лечения лейкемии, но проявляют низкую клиническую эффективность при лечении солидных опухолей. Это обусловлено недостаточной миграцией Т-клеток в опухоль и наличием иммуносупрессивной среды. Рекомбинантные онколитические вирусы способны не только избирательно разрушать раковые клетки, но и доставлять в них хемокины для активации и привлечения Т клеток из крови в опухоли. Новый подход для повышения эффективности иммунотерапии солидных опухолей сочетает использование CAR-T клеток с онколитическими вирусами.

Данный проект направлен на тестирование уже произведенных в лаборатории рекомбинантных VSV, несущих хемокины, в сочетании с CAR-T клетками, таргетирующими различные виды солидных опухолей. Эффективность данного подхода будет оценена как in vitro на раковых клеточных линиях, так и in vivo.    

Научный руководитель: Минская Екатерина Сергеевна – PhD, ведущий научный сотрудник направления «Генная терапия» Научно-технологического университета «Сириус», является автором более 20 научных работ, h-индекс 7, количество цитирований более 1000, работала в ведущих молекулярно-биологических и биохимических центрах Германии, Великобритании и Португалии по проектам в области создания моделей заболеваний, генетического редактирования, биоинженерии, иммунологии и вирусологии.

4) «Направленная эволюция ортогональных пар aaRS/tRNA для повышения селективности и эффективность встройки ароматических неканонических аминокислот в полипептиды»
5) «Разработка методов включения метилаланина (Aib) в полипептиды биосинтезом»
6) «Получение ортогональных пар aaRS/tRNA для включение алифатических неканонических аминокислот в полипептиды биосинтезом»

Проект направлен на разработку ортогональных пар аминоацил-tRNA-синтетаза/tRNA (aaRS/tRNA) способных включать в белки и пептиды неканонические/непротеиногенные аминокислоты (НПА), т.е. те, которые не входят в список аминокислот, участвующих в рибосомальном синтезе белка. Кроме самих ортогональных пар будет получен штамм E. coli в котором один из кодонов может быть использован для встройки дополнительной аминокислоты. В результате реализации первой части проекта планируется создать универсальную платформу на базе клеток Escherichia coli для быстрой и экономически эффективной селекции ортогональных аминоацил-тРНК-синтетаз (ааRS), селективно распознающих новые неприродные/ непротеиногеные аминокислоты (НПА), а также для получения НПА-содержащих белков и пептидов.

Применение универсальной платформы планируется для создания лекарственных средств белковой и пептидной природы. Для создания лекарственных средств потребуется: подготовить дизайн и провести синтез белков и пептидов, оценить их функциональные и физико-химические свойства, осуществить оптимизацию веществ, провести in vivo исследования лидерных соединений, провести доклинические исследования кандидата. В ходе выполнения проекта будет разработан рекомбинантный белок GLP1/GIP агонист, несущий неканонические аминокислоты для разработки на его основе лекарственных препаратов.

Включение аминокислота метил аланина или Aminoisobutyric acid (Aib) в пептиды важно для разработки новых вариантов пептидов устойчивых к протеолитическому воздействию в крови. Однако до настоящего времени в литературе отсутствует упоминание ортогональных пар aaRS/tRNA способных включать Aib в пептиды и белки. В литературе упоминается возможность включения Aib в белки и пептиды, но не с помощью ортогональных пар, а в результате ошибочной встройки с использованием стандартных клеточных механизмов или с использованием химической перезарядки tRNA в бесклеточных системах. В связи с чем разработка ортогональных пар aaRS/tRNA способных включать Aib в пептиды и белки in vivo является важной задачей как с прикладной, так и фундаментальной точек зрения.

Научный руководитель: Алексей Сергеевич Розанов – кандидат биологических наук.